Assistenskirkegården blev indviet den 16. maj 1811 på jorderne uden for byens vestre port, og det var på det tidspunkt langt uden for byens mure. Med tiden var pladsen på kirkegårdene inde i byen blevet så trang, at der måtte gøres noget for at imødegå behovet. Man anlagde derfor en kirkegård til at assistere byens kirkegårde, deraf navnet Assistenskirkegården.

Kirkegården blev anlagt på arealet mellem Rugårdslandevej og Odense Å, hvor der dengang lå store ubenyttede engarealer og områder. Disse områder blev på dette tidspunkt benyttet af byens natmænd til at bortskaffe byens efterladenskaber.

Arealet tættest på byen var desuden blevet anvendt til teltplads for de spanske og franske tropper under Napoleonskrigene. De første, der blev begravet på arealet, var derfor nogle af disse soldater. Byens borgere havde derfor store fordomme mod at skulle begraves her, hvor både henrettede soldater og katolikker lå begravet.

Biskop Peder Hansen, der havde arbejdet meget for etableringen af den nye kirkegård, døde i 1810 og blev midlertidigt begravet ved Sct. Knuds Kirke, før han kunne blive genbegravet til indvielsen. Den nye kirkegård blev inddelt, så de gamle bykirker havde hver deres del af kirkegården.

Allerede i 1806 havde byens kirkelige myndigheder kontaktet slotsgartner ved Odense Slot, Hans von Müller. Planter og træer til den nye kirkegård blev fremelsket i slottets have. Der blev lagt vægt på, at det skulle være en have; et præg kirkegården har bevaret helt frem til i dag.

Kirkegården er udvidet i flere tempi frem til 1947. Kirkegårdens forskellige dele afspejler de behov og den samtid, de er et produkt af.